Tesis Doctoral
Director:
Supervisors:
Manuel Becana, Mª Carmen Rubio
Fecha de presentación:
31-10-2019
Facultad/Escuela y Universidad:
Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid
Calificación:
Sobresaliente cum laude
Título:
Metabolismo de Molibdeno en Azotobacter vinelandii y sus aplicaciones biotecnológicas
Resumen:
La fijación biológica de nitrógeno realizada por un grupo de microorganismos denominados diazotrofos es clave para las prácticas agrícolas sostenibles. Los diazotrofos usan nitrogenasas para reducir el N2 en NH3. Dependiendo de la composición metálica de sus cofactores en el sitio activo, las nitrogenasas se clasifican como Mo, V o Fe- nitrogenasas, que transportan FeMo-co, FeV-co o FeFe-co, respectivamente. Azotobacter vinelandii alberga los tres tipos de nitrogenasas, pero preferentemente expresa la Mo nitrogenasa, ya que la presencia de molibdato en el medio reprime las otras dos. En esta tesis hemos realizado un análisis genético y bioquímico de la proteína de almacenamiento de molibdeno (MoSto) única de A. vinelandii que es codificada por los genes mosA y mosB. Debido a que MoSto permite la acumulación de enormes cantidades de Mo dentro de la célula, también hemos investigado su aplicación en el desarrollo de cepas de levadura fijadoras de N2. Mostramos que MoSto confiere a A. vinelandii una ventaja competitiva en situaciones de privación transitoria de Mo. También proporciona resistencia contra W, un metal que deteriora la actividad de las enzimas Mo, como la nitrogenasa. Además, MoSto amortigua los efectos reguladores de la reducción transitoria de Mo, evitando la desrepresión temprana de genes de las nitrogenasas alternativas. El Mo almacenado en MoSto es biológicamente activo, ya que MoSto purificado reemplaza al molibdato en el ensayo de síntesis in vitro de FeMo-co. Las propiedades de MoSto lo convierten en un componente deseable para una ruta de ingeniería genética de Mo a la nitrogenasa en S. cerevisiae. De hecho, mostramos aquí que la expresión y el direccionamiento de MoSto a la matriz mitocondrial protegió a S. cerevisiae de la toxicidad de Mo y además permitieron la maduración de NifQ co-expresado en una forma completamente activa. Como NifQ es el donante fisiológico de Mo para FeMo-co en A. vinelandii y otros diazotrofos, el logro de NifQ funcional completó la vía de Mo en las mitocondrias de S. cerevisiae. Por lo tanto, la vía Mo diseñada requirió, como mínimo, la incorporación de genes nifQ, mosA y mosB en el cromosoma. Los genes que codifican los transportadores de molibdato podrían ser necesarios en ciertos fondos genéticos de levadura o condiciones de crecimiento.
