Tesis Defendidas

Andrea Jiménez Leiva

Socorro Mesa Banqueri y María Jesús Delgado Igeño

09-07-2019

Facultad de Ciencias, Universidad de Granada

Sobresaliente cum laude

Caracterización molecular de las proteínas FixK₂ y NnrR que controlan la desnitrificación en Bradyrhizobium diazoefficiens

Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han demostrado que los genes nosRZDFYLX de Bradyrhizobium diazoefficiens que codifican la síntesis de la óxido nitroso reductasa (Nos) constituyen una unidad transcripcional única, cuya expresión depende principalmente del promotor presente en la región 5’ del gen nosR, donde se identificaron dos inicios de la trascripción, TSS₁ y TSS₂ a 84 y 57 nt del ATG, respectivamente. Estudios de actividad β-galactosidasa de una fusión transcripcional nosR–lacZ y de expresión y actividad de la enzima Nos han demostrado que las condiciones limitantes de O₂ constituyen la principal señal que induce la expresión de estos genes, siendo la proteína FixK₂ la que controla y activa directamente la transcripción del operón nosRZDFYLX in vitro.

En B. diazoefficiens, la expresión los genes de la desnitrificación está sujeto al control por dos factores transcripcionales de tipo CRP/FNR, FixK₂ y NnrR, en respuesta, respectivamente, a microoxia y óxidos de nitrógeno, en particular, óxido nítrico.  Durante el desarrollo de esta Tesis se han identificado más de 170 genes simultáneamente inducidos en condiciones desnitrificantes y bajo el control positivo de NnrR. Entre ellos, el gen cycA, que codifica el citocromo soluble c₅₅₀, previamente descrito como donador de electrones intermediario entre el complejo de membrana bc₁ y la NirK. En este trabajo, se ha podido demostrar, también, la implicación de CycA en la actividad de la enzima óxido nitroso reductasa (Nos). Cuando se profundizó en la regulación del gen cycA, además del control por NnrR, se observó un control por la proteína FixK₂ en condiciones de anoxia con nitrato, tanto a nivel transcripcional como traduccional. Es más, en ensayos de transcripción in vitro se pudo demostrar que la activación de la transcripción del gen cycA está controlada de forma directa por FixK₂. Igualmente, en este trabajo se han identificado nnrR y nnrS, un gen localizado de forma divergente a nnrR, como dianas directas de FixK₂.

Estudios in vivo llevados a cabo con el objeto de profundizar en el mecanismo molecular del regulador NnrR revelaron la implicación del hemo como cofactor de NnrR. La implicación del hemo como cofactor de NnrR también se estudió en ensayos in vitro. De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede proponer que el hemo es el cofactor más probable de NnrR que interviene en el mecanismo de detección de NO.

Finalmente, en esta Tesis se han identificado los determinantes moleculares de la interacción discriminatoria de las proteínas FixK₂ y NnrR con sus secuencias de reconocimiento (caja FixK₂, caja NnrR). En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral contribuyen a aumentar el conocimiento relacionado con la regulación de la desnitrificación en B. diazoefficiens, rizobio modelo para el estudio de dicho proceso. Concretamente, se ha avanzado en el mecanismo molecular implicado en el control de la desnitrificación mediado por las proteínas FixK₂ y NnrR. Esto ha permitido identificar un solo nucleótido en la secuencia de reconocimiento de ADN como residuo clave para la modulación por la proteína FixK₂. del metabolismo microóxico o desnitrificante de B. diazoefficiens.

Mónica Navarro Rodríguez

Manuel Becana, Mª Carmen Rubio

31-10-2019

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Metabolismo de Molibdeno en Azotobacter vinelandii y sus aplicaciones biotecnológicas

La fijación biológica de nitrógeno realizada por un grupo de microorganismos denominados diazotrofos es clave para las prácticas agrícolas sostenibles. Los diazotrofos usan nitrogenasas para reducir el N₂ en NH₃. Dependiendo de la composición metálica de sus cofactores en el sitio activo, las nitrogenasas se clasifican como Mo, V o Fe- nitrogenasas, que transportan FeMo-co, FeV-co o FeFe-co, respectivamente. Azotobacter vinelandii alberga los tres tipos de nitrogenasas, pero preferentemente expresa la Mo nitrogenasa, ya que la presencia de molibdato en el medio reprime las otras dos. En esta tesis hemos realizado un análisis genético y bioquímico de la proteína de almacenamiento de molibdeno (MoSto) única de A. vinelandii que es codificada por los genes mosA y mosB. Debido a que MoSto permite la acumulación de enormes cantidades de Mo dentro de la célula, también hemos investigado su aplicación en el desarrollo de cepas de levadura fijadoras de N₂. Mostramos que MoSto confiere a A. vinelandii una ventaja competitiva en situaciones de privación transitoria de Mo. También proporciona resistencia contra W, un metal que deteriora la actividad de las enzimas Mo, como la nitrogenasa. Además, MoSto amortigua los efectos reguladores de la reducción transitoria de Mo, evitando la desrepresión temprana de genes de las nitrogenasas alternativas. El Mo almacenado en MoSto es biológicamente activo, ya que MoSto purificado reemplaza al molibdato en el ensayo de síntesis in vitro de FeMo-co. Las propiedades de MoSto lo convierten en un componente deseable para una ruta de ingeniería genética de Mo a la nitrogenasa en S. cerevisiae. De hecho, mostramos aquí que la expresión y el direccionamiento de MoSto a la matriz mitocondrial protegió a S. cerevisiae de la toxicidad de Mo y además permitieron la maduración de NifQ co-expresado en una forma completamente activa. Como NifQ es el donante fisiológico de Mo para FeMo-co en A. vinelandii y otros diazotrofos, el logro de NifQ funcional completó la vía de Mo en las mitocondrias de S. cerevisiae. Por lo tanto, la vía Mo diseñada requirió, como mínimo, la incorporación de genes nifQ, mosA y mosB en el cromosoma. Los genes que codifican los transportadores de molibdato podrían ser necesarios en ciertos fondos genéticos de levadura o condiciones de crecimiento.

Irene Villar Rúa

Manuel Becana, Mª Carmen Rubio

02-10-2020

Facultad de Ciencias, Universidad de Zaragoza

Sobresaliente cum laude

Estructura y función de hemoglobinas atípicas de leguminosas modelo

En esta tesis hemos llevado a cabo la caracterización bioquímica de leghemoglobinas (Lbs) y hemoglobinas no simbióticas (Glbs) atípicas de las leguminosas modelo Medicago truncatula y Lotus japonicus.

El primer objetivo fue identificar y caracterizar una Glb de clase 1 de M. truncatula, denominada MtGlb1-2 (Medtr4g068870). Localizamos la expresión de este gen en los meristemos y haces vasculares de las raíces y nódulos. Este gen da lugar a cuatro transcritos alternativos, que codifican proteínas con uno o dos dominios hemo. Este es un caso único en plantas. Utilizando una combinación de espectroscopías, que incluyen UV-visible, fotólisis por flash de láser, resonancia Raman y resonancia paramagnética electrónica, caracterizamos dos de dichas proteínas: MtGlb1‑2.1 con dos hemos y MtGlb1-2.4 con un único hemo. Para investigar la funcionalidad de los hemos, generamos proteínas mutantes remplazando las histidinas distales por leucinas. Nuestro estudio muestra que MtGlb1-2.1 y MtGlb1-2.4 tienen una reactividad extrema con ligandos fisiológicos como oxígeno, óxido nítrico (NO) y nitrito, así como con el ligando modelo monóxido de carbono. Estas características inusuales nos llevan a proponer que MtGlb1‑2 puede actuar secuestrando o produciendo NO, dependiendo de la disponibilidad de oxígeno en las células vegetales.

El segundo objetivo fue caracterizar las hemoglobinas MtLb3 (Medtr1g090810) de M. truncatula y LjGlb2-1 (Lj5g3v1699110) de L. japonicus. LjGlb2-1 está anotada en las bases de datos como Lb, pero nuestros resultados indican que es una Lb anómala o bien una Glb de clase 2. Los ensayos bioquímicos mostraron que tanto LjGlb2-1 como MtLb3 tienen propiedades inusuales en su interacción con NO y en sus actividades nitrito reductasa (reducción de nitrito a NO en microaerobiosis) y NO dioxigenasa (dioxigenación de NO a nitrato en aerobiosis). Estas actividades son intermedias entre las descritas para las Lbs y las Glbs. Finalmente, realizamos un fenotipado de las plantas mutantes en cada gen en condiciones simbióticas y no simbióticas. Este fenotipado indicó que la MtLb3 puede ser irrelevante en el crecimiento de la planta en condiciones normales, mientras que LjGlb2‑1 es importante para el crecimiento y nodulación y participa en los procesos de floración y fructificación de las plantas noduladas.

Ana Salas Huertas

María Jesús Delgado Igeño

06-03-2020

Facultad de Ciencias, Universidad de Granada

Sobresaliente cum laude

Exploring the role of the haemoglobin from Bradyrhizobium diazoefficiens in nitric oxide detoxification during free-living and endosymbiotic lifestyles

En esta Tesis Doctoral, se ha demostrado el papel in vitro de la hemoglobina Bjgb y la flavoproteína Flp de B. diazoefficiens en el metabolismo del NO. Se ha demostrado la capacidad de Flp de reducir a Bjgb. Una vez reducida la Bjgb, el grupo hemo de esta proteína es capaz de unir NO. Con estos resultados se ha demostrado la capacidad de Bjgb de unir NO in vitro, lo cual confirmaría el papel de esta proteína de destoxificar NO in vivo.

En esta Tesis Doctoral, también se ha abordado el estudio de la implicación de la Bjgb de B. diazoefficiens en la interacción simbiótica con plantas de soja y en la homeostasis de NO en los nódulos. Mediante la técnica de la dilución isotópica del ¹⁵N y análisis de la actividad y expresión de la enzima nitrogenasa, se ha demostrado que la inoculación de las plantas de soja con la cepa mutante en Bjgb confiere tolerancia al encharcamiento. Este efecto se debe a la reducción de la acumulación de NO en los nódulos que es debida a la inducción de la expresión y actividad de la óxido nítrico reductasa (Nor), la cual es la principal proteína implicada en la eliminación de NO en los nódulos de soja.

Por último, se ha estudiado la implicación en simbiosis del proceso de asimilación de NO₃^–. Mediante el análisis de la actividad nitrogenasa y contenido en leghemoglobina (Lb) de los nódulos de soja, se ha demostrado que la nitrato reductasa asimilativa (NasC) no tiene un papel relevante en la reducción de NO₃^– en los bacteroides, siendo la nitrato reductasa periplásmica (NapA) la principal enzima implicada.

Los resultados obtenidos durante esta Tesis Doctoral han contribuido a incrementar el conocimiento sobre la función in vivo e in vitro de la proteína Bjgb de B. diazoefficiens en la destoxificación de NO, tanto en vida libre como en asociación simbiótica con plantas de soja. Además, se ha establecido el posible papel de las proteínas NasC y NirA de B. diazoefficiens en la simbiosis con plantas de soja.

Lucía Payá Tormo

Luis Manuel Rubio Herrero y Carlos Echavarri Erasun

26-02-2021

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Aprendizaje de la biosíntesis de la nitrogenasa a partir de procariotas termófilos

En función de la composición de sus cofactores metálicos, esenciales para su actividad, las nitrogenasas se clasifican en: nitrogenasas de molibdeno, vanadio, o sólo hierro. Todos los diazotrofos contienen al menos la nitrogenasa de molibdeno, mientras que otros pueden contener adicionalmente las nitrogenasas de vanadio y/o hierro. Las nitrogenasas de molibdeno, así como las proteínas requeridas para su ensamblaje y función, están codificadas por los genes nif, cuya cantidad y composición varía en función de la fisiología y ecología de cada diazotrofo. Se ha establecido un mínimo de seis genes nif como esenciales para la nitrogenasa de molibdeno (nifHDKENB). Aquí investigamos la nitrogenasa de la bacteria termófila Roseiflexus sp. RS-1, que parece depender exclusivamente de cuatro genes (nifHBDK). Los componentes estructurales de la nitrogenasa NifH y NifDK, así como el componente biosintético NifB, han sido caracterizados, demostrando su funcionalidad in vitro. En Roseiflexus la síntesis del cofactor de hierro y molibdeno (FeMo-co) es independiente de NifEN, mientras que NifDK parece tener una capacidad dual, participando en la maduración de FeMo-co así como, manteniendo su actividad nitrogenasa. Estos resultados sugieren que Roseiflexus sp. posee un complejo enzimático que se asemeja al predecesor de las nitrogenasas de molibdeno actuales antes de los eventos de duplicación y divergencia de los genes nifDK y nifEN. Además, esta tesis incluye la primera descripción de la estructura de NifB obtenida por rayos X. Debido a que la proteína NifB de Roseiflexus sp. RS-1 no pudo ser cristalizada, la estructura de su homólogo procedente de Methanotrix thermoacetophila fue finalmente resuelta en colaboración con Yvain Nicolet del “Institute de Biologie Structurale”. Describimos una coordinación novedosa de uno de los cofactores [Fe₄S₄] y una región flexible delimitada por los residuos C62 y E65 que tiene un papel central en la coordinación de la unión y catálisis de la molécula de SAM, y en la estabilización de los cofactores [Fe₄S₄] previa a la formación de NifB-co.

Álvaro Eseverri Sabaté

Luis Manuel Rubio Herrero y Elena Caro Bernat

01-03-2021

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Esfuerzos de la biología sintética en la ingeniería de la biosíntesis de la proteína nitrogenasa Fe en los plastos

La generación de cultivos capaces de llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno es un desafío que podría conducir a una nueva revolución agrícola. Un posible enfoque para la generación de estos cultivos se basa en la transferencia directa de genes bacterianos nif, necesarios para la biogénesis de la nitrogenasa, al genoma de la planta. Los cloroplastos de plantas podrían albergar una enzima nitrogenasa activa, ya que contienen poder reductor y abundancia de ATP, a pesar de la presencia de oxígeno. Este trabajo presenta el uso de herramientas de biología sintética para optimizar la producción de la proteína de hierro de la nitrogenasa (NifH) en cloroplastos de Nicotiana benthamiana. Los genes nifH, M, U y S de Azotobacter vinelandii se rediseñaron para aumentar la acumulación de sus proteínas en células de tabaco, y su importación al cloroplasto se optimizó mediante péptidos de tránsito que funcionaran correctamente para cada proteína Nif. La proteína NifM, una supuesta peptidil-prolil cis-trans isomerasa, fue necesaria para la obtención de proteína NifH soluble en el estroma de los cloroplastos. La proteína NifH purificada a partir de cloroplastos de tabaco fue activa siempre que se co-expresara junto a NifU y NifS. El mismo conjunto de genes de A. vinelandii se rediseñó para aumentar la acumulación de sus proteínas en Oryza sativa y los péptidos de tránsito se probaron para determinar su eficacia en la importación de una proteína marcadora a plastidios de diferentes tejidos de arroz. Los péptidos de tránsito de A. thaliana seleccionados también fueron capaces de mediar la importación de las proteínas Nif a cloroplastos de hojas de arroz. NifM también resultó necesaria para la solubilidad de NifH en arroz. Sin embargo, no pudimos obtener plantas transgénicas de arroz que acumularan proteínas Nif en cloroplastos y, por lo tanto, la actividad NifH en cereales sigue siendo una incógnita. En conjunto, presentamos una prueba de concepto del uso de cloroplastos para albergar nitrogenasa, y un procedimiento de optimización para expresar cualquier transgen codificado en el núcleo dirigido a plastidios de N. benthamiana y O. sativa, centrándose en el diseño de versiones sintéticas de genes que confieren una mayor acumulación de proteína y caracterizando un conjunto de péptidos de tránsito que dirigen de manera eficiente sus proteínas transportadas mientras minimizan los aminoácidos remanentes en la proteína madura tras la importación.

Xi Jiang

Luis Manuel Rubio Herrero y Stefan Burén

11-03-2022

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Identificación de las proteínas NifH y NifB óptimas para la ingeniería de la nitrogenasa en eucariotas

Los problemas asociados al uso masivo de fertilizantes nitrogenados sintéticos, necesarios para mantener un alto rendimiento de los cultivos, podrían aliviarse mediante la transferencia de la capacidad de fijación biológica del nitrógeno (BNF) a las especies cultivadas. La nitrogenasa, la enzima que cataliza la BNF, está formada por NifH y NifDK y requiere además al menos las proteínas NifB y NifEN, ya que éstas sintetizan el cofactor metálico del sitio activo de la nitrogenasa llamado FeMo-co. Dos componentes clave para la ingeniería de la nitrogenasa en los cultivos son la NifH, que se requiere a altas concentraciones celulares, y la NifB. Los intentos anteriores de expresar NifH y NifB en plantas se enfrentaban a problemas de solubilidad e inestabilidad. En esta tesis, establecimos una línea de trabajo para identificar las proteínas NifH y NifB adecuadas para la ingeniería de plantas y utilizarlas para obtener líneas de arroz transgénico. Se expresaron dos bibliotecas de genes que contenían 32 variantes de NifH y 30 de NifB y se dirigieron a mitocondrias de tabaco (para NifH) o a mitocondrias y cloroplastos de tabaco (para NifB). El cribado de la biblioteca de NifH en el tabaco identificó una variante de NifH de Hydrogenobacter thermophilus que se acumulaba de forma soluble y a altos niveles en las mitocondrias de la levadura, el tabaco y el arroz, y mostraba actividad in vitro cuando se purificaba de todas ellas. El cribado de NifB identificó variantes de la archaea Methanocaldococcus infernus, Methanothermobacterium thermautotrophicus y Methanosarcina acetivorans como solubles, estables y activas cuando se purificaron a partir de mitocondrias y cloroplastos de tabaco. También se generaron líneas transgénicas de arroz que acumulan NifB de M. infernus o M. thermautotrophicus en las mitocondrias, y se demostró que NifB favorece la síntesis de FeMo-co in vitro. Demostramos que es posible identificar proteínas con estabilidad y solubilidad mejoradas, mediante el cribado de bibliotecas genéticas basadas en el conocimiento que consisten en proteínas homólogas de diverso origen filogenético. La identificación y expresión de una variante de NifH, y de tres variantes de NifB, con propiedades superiores en el tabaco y el arroz, sienta las bases para la transferencia de la capacidad de fijación de nitrógeno a cultivos de interés agronómico.

Natalia Isabel García Tomsing

José Ignacio Jiménez Zurdo, Marta Robledo Garrido

31-05-2022

Universidad de Granada

Sobresaliente cum laude

Regulación por RNA del metabolismo del simbionte de leguminosas Sinorhizobium meliloti

La regulación post-transcripcional de la expresión génica asistida por RNAs no codificantes (sRNA) es un mecanismo ubicuo de adaptación de las bacterias a entornos fluctuantes. Los llamados trans-sRNAs se expresan diferencialmente desde regiones intergénicas y regulan la traducción y/o estabilidad de múltiples mRNA diana mediante interacciones entre series cortas y discontinuas de nucleótidos complementarios. Una primera caracterización de los trans-sRNAs homólogos AbcR1 y AbcR2 (ABC Regulators) y del trans-sRNA requerido para la nodulación, NfeR1 (Nodule Formation Efficiency Regulator), anticipaban un gran impacto de la riboregulación en el metabolismo del simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti.

En esta Tesis hemos descifrado la arquitectura de la red reguladora gobernada por AbcR1/2 y NfeR1 y su función en el metabolismo adaptativo de S. meliloti. La expresión de AbcR1 ocurre durante el crecimiento exponencial de las bacterias y depende del regulador transcripcional de tipo LysR, LsrB, mientras que AbcR2 responde a estrés y se transcribe por el factor σ alternativo de la RNA polimerasa, RpoH1. Por su parte, la expresión de NfeR1 está bajo el control de un promotor complejo activado por LsrB y reprimido por el regulador máster de la respuesta a estrés de nitrógeno NtrC. La caracterización a escala genómica de los respectivos regulones reveló que AbcR1, AbcR2 y NfeR1 interaccionan con un número excepcionalmente grande de mRNAs, parte de los cuales son dianas compartidas, que codifican mayoritariamente proteínas de transporte y catabólicas, contribuyendo así a la reprogramación del metabolismo de S. melitoti durante la transición simbiótica. AbcR1 mejora la capacidad de S. meliloti para colonizar el rizoplano de la raíz, mientras que NfeR1 potencia la respuesta de S. meliloti al estrés de nitrógeno. MetK, sintetasa del donador de grupos metilo S-adenosilmetionina, así como las endorribonucleasas YbeY y RNasa III son proteínas que contribuyen a la regulación por AbcR1/2 y NfeR1 mediante mecanismos todavía desconocidos. La riboregulación se basa en apareamientos modificables entre moléculas de RNA, por lo que estas redes reguladoras podrían reprogramarse a diferentes niveles, abriendo así vías aún inexploradas para la ingeniería de biofertilizantes altamente competitivos y la fijación simbiótica de nitrógeno en la práctica agrícola sostenible.