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Álvaro Eseverri Sabaté

Luis Manuel Rubio Herrero y Elena Caro Bernat

01-03-2021

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Esfuerzos de la biología sintética en la ingeniería de la biosíntesis de la proteína nitrogenasa Fe en los plastos

La generación de cultivos capaces de llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno es un desafío que podría conducir a una nueva revolución agrícola. Un posible enfoque para la generación de estos cultivos se basa en la transferencia directa de genes bacterianos nif, necesarios para la biogénesis de la nitrogenasa, al genoma de la planta. Los cloroplastos de plantas podrían albergar una enzima nitrogenasa activa, ya que contienen poder reductor y abundancia de ATP, a pesar de la presencia de oxígeno. Este trabajo presenta el uso de herramientas de biología sintética para optimizar la producción de la proteína de hierro de la nitrogenasa (NifH) en cloroplastos de Nicotiana benthamiana. Los genes nifH, M, U y S de Azotobacter vinelandii se rediseñaron para aumentar la acumulación de sus proteínas en células de tabaco, y su importación al cloroplasto se optimizó mediante péptidos de tránsito que funcionaran correctamente para cada proteína Nif. La proteína NifM, una supuesta peptidil-prolil cis-trans isomerasa, fue necesaria para la obtención de proteína NifH soluble en el estroma de los cloroplastos. La proteína NifH purificada a partir de cloroplastos de tabaco fue activa siempre que se co-expresara junto a NifU y NifS. El mismo conjunto de genes de A. vinelandii se rediseñó para aumentar la acumulación de sus proteínas en Oryza sativa y los péptidos de tránsito se probaron para determinar su eficacia en la importación de una proteína marcadora a plastidios de diferentes tejidos de arroz. Los péptidos de tránsito de A. thaliana seleccionados también fueron capaces de mediar la importación de las proteínas Nif a cloroplastos de hojas de arroz. NifM también resultó necesaria para la solubilidad de NifH en arroz. Sin embargo, no pudimos obtener plantas transgénicas de arroz que acumularan proteínas Nif en cloroplastos y, por lo tanto, la actividad NifH en cereales sigue siendo una incógnita. En conjunto, presentamos una prueba de concepto del uso de cloroplastos para albergar nitrogenasa, y un procedimiento de optimización para expresar cualquier transgen codificado en el núcleo dirigido a plastidios de N. benthamiana y O. sativa, centrándose en el diseño de versiones sintéticas de genes que confieren una mayor acumulación de proteína y caracterizando un conjunto de péptidos de tránsito que dirigen de manera eficiente sus proteínas transportadas mientras minimizan los aminoácidos remanentes en la proteína madura tras la importación.

Lucía Payá Tormo

Luis Manuel Rubio Herrero y Carlos Echavarri Erasun

26-02-2021

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Aprendizaje de la biosíntesis de la nitrogenasa a partir de procariotas termófilos

En función de la composición de sus cofactores metálicos, esenciales para su actividad, las nitrogenasas se clasifican en: nitrogenasas de molibdeno, vanadio, o sólo hierro. Todos los diazotrofos contienen al menos la nitrogenasa de molibdeno, mientras que otros pueden contener adicionalmente las nitrogenasas de vanadio y/o hierro. Las nitrogenasas de molibdeno, así como las proteínas requeridas para su ensamblaje y función, están codificadas por los genes nif, cuya cantidad y composición varía en función de la fisiología y ecología de cada diazotrofo. Se ha establecido un mínimo de seis genes nif como esenciales para la nitrogenasa de molibdeno (nifHDKENB). Aquí investigamos la nitrogenasa de la bacteria termófila Roseiflexus sp. RS-1, que parece depender exclusivamente de cuatro genes (nifHBDK). Los componentes estructurales de la nitrogenasa NifH y NifDK, así como el componente biosintético NifB, han sido caracterizados, demostrando su funcionalidad in vitro. En Roseiflexus la síntesis del cofactor de hierro y molibdeno (FeMo-co) es independiente de NifEN, mientras que NifDK parece tener una capacidad dual, participando en la maduración de FeMo-co así como, manteniendo su actividad nitrogenasa. Estos resultados sugieren que Roseiflexus sp. posee un complejo enzimático que se asemeja al predecesor de las nitrogenasas de molibdeno actuales antes de los eventos de duplicación y divergencia de los genes nifDK y nifEN. Además, esta tesis incluye la primera descripción de la estructura de NifB obtenida por rayos X. Debido a que la proteína NifB de Roseiflexus sp. RS-1 no pudo ser cristalizada, la estructura de su homólogo procedente de Methanotrix thermoacetophila fue finalmente resuelta en colaboración con Yvain Nicolet del “Institute de Biologie Structurale”. Describimos una coordinación novedosa de uno de los cofactores [Fe₄S₄] y una región flexible delimitada por los residuos C62 y E65 que tiene un papel central en la coordinación de la unión y catálisis de la molécula de SAM, y en la estabilización de los cofactores [Fe₄S₄] previa a la formación de NifB-co.

Irene Villar Rúa

Manuel Becana, Mª Carmen Rubio

02-10-2020

Facultad de Ciencias, Universidad de Zaragoza

Sobresaliente cum laude

Estructura y función de hemoglobinas atípicas de leguminosas modelo

En esta tesis hemos llevado a cabo la caracterización bioquímica de leghemoglobinas (Lbs) y hemoglobinas no simbióticas (Glbs) atípicas de las leguminosas modelo Medicago truncatula y Lotus japonicus.

El primer objetivo fue identificar y caracterizar una Glb de clase 1 de M. truncatula, denominada MtGlb1-2 (Medtr4g068870). Localizamos la expresión de este gen en los meristemos y haces vasculares de las raíces y nódulos. Este gen da lugar a cuatro transcritos alternativos, que codifican proteínas con uno o dos dominios hemo. Este es un caso único en plantas. Utilizando una combinación de espectroscopías, que incluyen UV-visible, fotólisis por flash de láser, resonancia Raman y resonancia paramagnética electrónica, caracterizamos dos de dichas proteínas: MtGlb1‑2.1 con dos hemos y MtGlb1-2.4 con un único hemo. Para investigar la funcionalidad de los hemos, generamos proteínas mutantes remplazando las histidinas distales por leucinas. Nuestro estudio muestra que MtGlb1-2.1 y MtGlb1-2.4 tienen una reactividad extrema con ligandos fisiológicos como oxígeno, óxido nítrico (NO) y nitrito, así como con el ligando modelo monóxido de carbono. Estas características inusuales nos llevan a proponer que MtGlb1‑2 puede actuar secuestrando o produciendo NO, dependiendo de la disponibilidad de oxígeno en las células vegetales.

El segundo objetivo fue caracterizar las hemoglobinas MtLb3 (Medtr1g090810) de M. truncatula y LjGlb2-1 (Lj5g3v1699110) de L. japonicus. LjGlb2-1 está anotada en las bases de datos como Lb, pero nuestros resultados indican que es una Lb anómala o bien una Glb de clase 2. Los ensayos bioquímicos mostraron que tanto LjGlb2-1 como MtLb3 tienen propiedades inusuales en su interacción con NO y en sus actividades nitrito reductasa (reducción de nitrito a NO en microaerobiosis) y NO dioxigenasa (dioxigenación de NO a nitrato en aerobiosis). Estas actividades son intermedias entre las descritas para las Lbs y las Glbs. Finalmente, realizamos un fenotipado de las plantas mutantes en cada gen en condiciones simbióticas y no simbióticas. Este fenotipado indicó que la MtLb3 puede ser irrelevante en el crecimiento de la planta en condiciones normales, mientras que LjGlb2‑1 es importante para el crecimiento y nodulación y participa en los procesos de floración y fructificación de las plantas noduladas.

Ana Salas Huertas

María Jesús Delgado Igeño

06-03-2020

Facultad de Ciencias, Universidad de Granada

Sobresaliente cum laude

Exploring the role of the haemoglobin from Bradyrhizobium diazoefficiens in nitric oxide detoxification during free-living and endosymbiotic lifestyles

En esta Tesis Doctoral, se ha demostrado el papel in vitro de la hemoglobina Bjgb y la flavoproteína Flp de B. diazoefficiens en el metabolismo del NO. Se ha demostrado la capacidad de Flp de reducir a Bjgb. Una vez reducida la Bjgb, el grupo hemo de esta proteína es capaz de unir NO. Con estos resultados se ha demostrado la capacidad de Bjgb de unir NO in vitro, lo cual confirmaría el papel de esta proteína de destoxificar NO in vivo.

En esta Tesis Doctoral, también se ha abordado el estudio de la implicación de la Bjgb de B. diazoefficiens en la interacción simbiótica con plantas de soja y en la homeostasis de NO en los nódulos. Mediante la técnica de la dilución isotópica del ¹⁵N y análisis de la actividad y expresión de la enzima nitrogenasa, se ha demostrado que la inoculación de las plantas de soja con la cepa mutante en Bjgb confiere tolerancia al encharcamiento. Este efecto se debe a la reducción de la acumulación de NO en los nódulos que es debida a la inducción de la expresión y actividad de la óxido nítrico reductasa (Nor), la cual es la principal proteína implicada en la eliminación de NO en los nódulos de soja.

Por último, se ha estudiado la implicación en simbiosis del proceso de asimilación de NO₃^–. Mediante el análisis de la actividad nitrogenasa y contenido en leghemoglobina (Lb) de los nódulos de soja, se ha demostrado que la nitrato reductasa asimilativa (NasC) no tiene un papel relevante en la reducción de NO₃^– en los bacteroides, siendo la nitrato reductasa periplásmica (NapA) la principal enzima implicada.

Los resultados obtenidos durante esta Tesis Doctoral han contribuido a incrementar el conocimiento sobre la función in vivo e in vitro de la proteína Bjgb de B. diazoefficiens en la destoxificación de NO, tanto en vida libre como en asociación simbiótica con plantas de soja. Además, se ha establecido el posible papel de las proteínas NasC y NirA de B. diazoefficiens en la simbiosis con plantas de soja.

Mónica Navarro Rodríguez

Manuel Becana, Mª Carmen Rubio

31-10-2019

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Metabolismo de Molibdeno en Azotobacter vinelandii y sus aplicaciones biotecnológicas

La fijación biológica de nitrógeno realizada por un grupo de microorganismos denominados diazotrofos es clave para las prácticas agrícolas sostenibles. Los diazotrofos usan nitrogenasas para reducir el N₂ en NH₃. Dependiendo de la composición metálica de sus cofactores en el sitio activo, las nitrogenasas se clasifican como Mo, V o Fe- nitrogenasas, que transportan FeMo-co, FeV-co o FeFe-co, respectivamente. Azotobacter vinelandii alberga los tres tipos de nitrogenasas, pero preferentemente expresa la Mo nitrogenasa, ya que la presencia de molibdato en el medio reprime las otras dos. En esta tesis hemos realizado un análisis genético y bioquímico de la proteína de almacenamiento de molibdeno (MoSto) única de A. vinelandii que es codificada por los genes mosA y mosB. Debido a que MoSto permite la acumulación de enormes cantidades de Mo dentro de la célula, también hemos investigado su aplicación en el desarrollo de cepas de levadura fijadoras de N₂. Mostramos que MoSto confiere a A. vinelandii una ventaja competitiva en situaciones de privación transitoria de Mo. También proporciona resistencia contra W, un metal que deteriora la actividad de las enzimas Mo, como la nitrogenasa. Además, MoSto amortigua los efectos reguladores de la reducción transitoria de Mo, evitando la desrepresión temprana de genes de las nitrogenasas alternativas. El Mo almacenado en MoSto es biológicamente activo, ya que MoSto purificado reemplaza al molibdato en el ensayo de síntesis in vitro de FeMo-co. Las propiedades de MoSto lo convierten en un componente deseable para una ruta de ingeniería genética de Mo a la nitrogenasa en S. cerevisiae. De hecho, mostramos aquí que la expresión y el direccionamiento de MoSto a la matriz mitocondrial protegió a S. cerevisiae de la toxicidad de Mo y además permitieron la maduración de NifQ co-expresado en una forma completamente activa. Como NifQ es el donante fisiológico de Mo para FeMo-co en A. vinelandii y otros diazotrofos, el logro de NifQ funcional completó la vía de Mo en las mitocondrias de S. cerevisiae. Por lo tanto, la vía Mo diseñada requirió, como mínimo, la incorporación de genes nifQ, mosA y mosB en el cromosoma. Los genes que codifican los transportadores de molibdato podrían ser necesarios en ciertos fondos genéticos de levadura o condiciones de crecimiento.