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Natalia Isabel García Tomsing

José Ignacio Jiménez Zurdo, Marta Robledo Garrido

31-05-2022

Universidad de Granada

Sobresaliente cum laude

Regulación por RNA del metabolismo del simbionte de leguminosas Sinorhizobium meliloti

La regulación post-transcripcional de la expresión génica asistida por RNAs no codificantes (sRNA) es un mecanismo ubicuo de adaptación de las bacterias a entornos fluctuantes. Los llamados trans-sRNAs se expresan diferencialmente desde regiones intergénicas y regulan la traducción y/o estabilidad de múltiples mRNA diana mediante interacciones entre series cortas y discontinuas de nucleótidos complementarios. Una primera caracterización de los trans-sRNAs homólogos AbcR1 y AbcR2 (ABC Regulators) y del trans-sRNA requerido para la nodulación, NfeR1 (Nodule Formation Efficiency Regulator), anticipaban un gran impacto de la riboregulación en el metabolismo del simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti.

En esta Tesis hemos descifrado la arquitectura de la red reguladora gobernada por AbcR1/2 y NfeR1 y su función en el metabolismo adaptativo de S. meliloti. La expresión de AbcR1 ocurre durante el crecimiento exponencial de las bacterias y depende del regulador transcripcional de tipo LysR, LsrB, mientras que AbcR2 responde a estrés y se transcribe por el factor σ alternativo de la RNA polimerasa, RpoH1. Por su parte, la expresión de NfeR1 está bajo el control de un promotor complejo activado por LsrB y reprimido por el regulador máster de la respuesta a estrés de nitrógeno NtrC. La caracterización a escala genómica de los respectivos regulones reveló que AbcR1, AbcR2 y NfeR1 interaccionan con un número excepcionalmente grande de mRNAs, parte de los cuales son dianas compartidas, que codifican mayoritariamente proteínas de transporte y catabólicas, contribuyendo así a la reprogramación del metabolismo de S. melitoti durante la transición simbiótica. AbcR1 mejora la capacidad de S. meliloti para colonizar el rizoplano de la raíz, mientras que NfeR1 potencia la respuesta de S. meliloti al estrés de nitrógeno. MetK, sintetasa del donador de grupos metilo S-adenosilmetionina, así como las endorribonucleasas YbeY y RNasa III son proteínas que contribuyen a la regulación por AbcR1/2 y NfeR1 mediante mecanismos todavía desconocidos. La riboregulación se basa en apareamientos modificables entre moléculas de RNA, por lo que estas redes reguladoras podrían reprogramarse a diferentes niveles, abriendo así vías aún inexploradas para la ingeniería de biofertilizantes altamente competitivos y la fijación simbiótica de nitrógeno en la práctica agrícola sostenible.

Xi Jiang

Luis Manuel Rubio Herrero y Stefan Burén

11-03-2022

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Identificación de las proteínas NifH y NifB óptimas para la ingeniería de la nitrogenasa en eucariotas

Los problemas asociados al uso masivo de fertilizantes nitrogenados sintéticos, necesarios para mantener un alto rendimiento de los cultivos, podrían aliviarse mediante la transferencia de la capacidad de fijación biológica del nitrógeno (BNF) a las especies cultivadas. La nitrogenasa, la enzima que cataliza la BNF, está formada por NifH y NifDK y requiere además al menos las proteínas NifB y NifEN, ya que éstas sintetizan el cofactor metálico del sitio activo de la nitrogenasa llamado FeMo-co. Dos componentes clave para la ingeniería de la nitrogenasa en los cultivos son la NifH, que se requiere a altas concentraciones celulares, y la NifB. Los intentos anteriores de expresar NifH y NifB en plantas se enfrentaban a problemas de solubilidad e inestabilidad. En esta tesis, establecimos una línea de trabajo para identificar las proteínas NifH y NifB adecuadas para la ingeniería de plantas y utilizarlas para obtener líneas de arroz transgénico. Se expresaron dos bibliotecas de genes que contenían 32 variantes de NifH y 30 de NifB y se dirigieron a mitocondrias de tabaco (para NifH) o a mitocondrias y cloroplastos de tabaco (para NifB). El cribado de la biblioteca de NifH en el tabaco identificó una variante de NifH de Hydrogenobacter thermophilus que se acumulaba de forma soluble y a altos niveles en las mitocondrias de la levadura, el tabaco y el arroz, y mostraba actividad in vitro cuando se purificaba de todas ellas. El cribado de NifB identificó variantes de la archaea Methanocaldococcus infernus, Methanothermobacterium thermautotrophicus y Methanosarcina acetivorans como solubles, estables y activas cuando se purificaron a partir de mitocondrias y cloroplastos de tabaco. También se generaron líneas transgénicas de arroz que acumulan NifB de M. infernus o M. thermautotrophicus en las mitocondrias, y se demostró que NifB favorece la síntesis de FeMo-co in vitro. Demostramos que es posible identificar proteínas con estabilidad y solubilidad mejoradas, mediante el cribado de bibliotecas genéticas basadas en el conocimiento que consisten en proteínas homólogas de diverso origen filogenético. La identificación y expresión de una variante de NifH, y de tres variantes de NifB, con propiedades superiores en el tabaco y el arroz, sienta las bases para la transferencia de la capacidad de fijación de nitrógeno a cultivos de interés agronómico.